Nature Communications 14권, 기사 번호: 4283(2023) 이 기사 인용
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핵 수용체인 Nurr1은 중뇌 도파민 뉴런의 발달과 유지 모두에 중요하며 파킨슨병(PD)에 대한 유망한 분자 표적을 나타냅니다. 우리는 이전에 동일한 화학 비계인 4-아미노-7-클로로퀴놀린(4A7C)을 공유하는 세 가지 Nurr1 작용제(아모디아퀸, 클로로퀸 및 글라페닌)를 확인했는데, 이는 구조-활성 관계를 시사합니다. 여기에서 우리는 570개 이상의 4A7C 유도체가 생성되고 특성화되는 체계적인 의약 화학 검색을 보고합니다. 여러 화합물은 Nurr1의 전사 활성을 향상시켜 시험관 내에서 강력한 신경 보호 효과를 나타내는 최적화된 뇌 침투 작용제인 4A7C-301을 식별합니다. 또한, 4A7C-301은 MPTP로 유발된 PD의 수컷 마우스 모델에서 중뇌 도파민 뉴런을 보호하고 이상운동증 유사 행동 없이 운동 및 비운동 후각 결함을 모두 개선합니다. 또한, 4A7C-301은 AAV2 매개 α-시누클레인 과발현 수컷 마우스 모델에서 신경병리학적 이상을 유의하게 개선하고 운동 및 후각 기능 장애를 개선합니다. 4A7C-301의 이러한 질병 수정 특성은 PD 환자 치료를 위한 이 화합물 또는 유사한 화합물의 임상적 평가를 보증할 수 있습니다.
65세 이상 인구의 2~3%에 영향을 미치는 파킨슨병(PD)은 알츠하이머병에 이어 두 번째로 흔한 신경퇴행성 질환입니다1,2,3. 흑색질의 중뇌 도파민 뉴런(mDAN)의 선택적 변성과 루이체의 신경독성 α-시누클레인(αSyn) 축적 및 응집은 PD의 특징적인 병리학적 특징입니다. PD의 발현은 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스, 신경 염증 및 조절 장애가 있는 단백질 분해/자가포식3,4,5,6,7을 포함한 다중 상호 작용 경로를 통한 유전적 요인과 환경적 요인의 복합적인 작용에 의해 발생하는 것으로 생각됩니다. 현재, 도파민(DA) 대체 요법(예: L-DOPA)이 최적의 치료법입니다. PD 환자의 삶의 질을 크게 향상시키는 반면, 운동이상증과 같은 용인할 수 없는 부작용이 없는 치료 기간과 혜택 정도는 시간이 지남에 따라 감소하며8,9 질병 진행을 중단하거나 늦출 수 있는 치료법은 없습니다. 따라서 PD10,11에 대한 새로운 질병 수정 치료법을 개발해야 하는 충족되지 않은 요구가 큽니다.
지난 수십 년 동안 mDAN의 전사 조절 단계는 포괄적으로 연구되었습니다. 두 가지 주요 mDAN 발달 경로(즉, Sonic hedgehog-FoxA2 및 Wnt1-Lmx1A)가 수렴하여 Nurr113,14,15를 유도하여 Nurr1이 mDAN의 마스터 조절 장치임을 강조합니다. 실제로 Nurr1 녹아웃(KO) 및 조건부 KO 마우스 연구는 Nurr1이 발달뿐만 아니라 성인 mDAN의 유지 관리에도 필수적이라는 것을 보여주었습니다. 또한 Nurr1은 신경독성 전염증 유전자의 발현을 억제함으로써 신경염증으로 인한 사망으로부터 mDAN을 보호하는 것으로 나타났습니다4. 또한, Nurr1 발현은 노인 및 산발성 PD 환자의 뇌에서 크게 감소하는 것으로 보고되었습니다18,19,20.
Nurr1은 핵 수용체 NR4A 서브패밀리에 속하며, 이는 Nurr1의 전사 기능이 합성 및/또는 내인성 리간드에 의해 조절될 수 있음을 시사합니다. 또한 Nurr1은 세포 상황에 따라 전사 활성화 인자 및 억제 인자로 기능할 수 있습니다(예: 각각 mDANs16 및 microglia4에서). Nurr1이 PD22의 질병 수정 치료를 위한 분자 표적이 될 수 있는지 여부를 확인하기 위해 우리는 높은 처리량 분석 시스템을 구축하고 이전에 US-FDA 승인 약물 라이브러리를 스크리닝했습니다. 우리는 리간드 결합 도메인(LBD)23에 직접 결합하여 Nurr1의 전사 활성을 크게 향상시키는 세 가지 약물, 즉 아모디아퀸(AQ), 클로로퀸(CQ) 및 글라페닌을 확인했습니다. 세 가지 약물 모두 동일한 화학적 비계를 공유했습니다. 4-아미노-7-클로로퀴놀린(4A7C)은 이 4A7C 모티프가 SAR 기반 약물을 통해 더 높은 효능과 더 적은 부작용을 가진 더 나은 4A7C 파생물을 식별하는 데 사용할 수 있는 구조-활성 관계(SAR)를 나타낸다는 가설을 촉발합니다. 화학24. 이 가설에 따라 Munoz-Tello et al. 25 및 Willems et al. 26,27은 AQ와 CQ 및 이들의 파생물이 Nurr1 작용제로 작용할 수 있음을 보여줍니다. Willemset al. 26은 또한 4A7C 약물단의 7-클로로 또는 4-아미노 그룹을 제거하면 활성이 손실된다고 보고했으며, 이는 4A7C가 강력한 Nurr1 작용제를 설계하는 데 유효한 약물단이라는 가설을 뒷받침합니다. 이를 위해 우리는 CQ를 시작 화합물로 사용하여 체계적인 의약화학 노력을 수행했습니다. 왜냐하면 CQ는 상대적으로 안전하고 말라리아 및 자가면역 질환과 같은 인간 질병을 치료하는 데 여전히 널리 사용되기 때문입니다. 우리는 생화학, 분자 및 세포 분석을 사용하여 여러(>570) 4A7C 파생물을 특성화하고 PD의 시험관 내 및 생체 내 모델 모두에서 강력하게 더 높은 효능을 나타내고 메커니즘 기반 신경 보호 효과를 제공하는 최종 후보인 4A7C-301을 확인했습니다. , PD의 환경적(미토콘드리아 복합체 I 억제제 1-메틸-4-피에닐피리디늄(MPP+))과 유전적(αSyn) 위험 인자 모델을 모두 별도로 사용합니다. L-DOPA 또는 CQ와 달리 4A7C-301은 이상운동증 유사 행동이나 자가포식 억제와 같은 부작용 없이 운동 및 비운동 기능 장애를 모두 크게 개선했습니다. 우리의 데이터는 최적화된 Nurr1 작용제가 산발성 및 가족성 PD 모두에 대한 질병 수정 치료를 제공할 수 있다는 원칙의 증거를 보여줍니다.
morpholine > piperidine, the derivative 4A7C-301 with highest fold-induction (18.12 fold) and significantly lower EC50 value (6.53 µM) than CQ (50.25 µM) was selected as a preclinical candidate for further studies (Fig. 1c; Supplementary Table 1). Brain permeability of 4A7C-301 was assessed by analysis of blood plasma and brain homogenates at different time points after oral administration in SD rats (20 mg/kg). 4A7C-301 penetrated into the brain well and was consistently maintained in the brain (Supplementary Fig. 1a–c)./p>60%) together with activation of ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba-1)-positive microglia. Pre-treatment with CQ or 4A7C-301 significantly rescued mDANs in a dose-dependent manner. 4A7C-301 showed maximal effect at 500 nM, which is a 40 times lower concentration than required for a similar CQ effect (20 µM) (Fig. 2d, e). In addition, 4A7C-301 optimally suppressed microglial activation against LPS at 500 nM, which is 40 times lower than CQ (Fig. 2f, g). To address whether CQ and 4A7C-301 can suppress the expression of pro-inflammatory genes in microglia (in the absence of mDANs), we used LPS to induce inflammation in mouse microglia-derived BV2 cells, leading to a dramatic induction of the tumor-necrosis factor-α (TNFα) gene, which was robustly suppressed by CQ and 4A7C-301 (Supplementary Fig. 6). In this assay, 4A7C-301 exhibited a much higher potency than CQ, with EC50 of ~1 and ~100 nM, respectively. Collectively, our data show that 4A7C-301 protects mDANs from MPP+- and LPS-induced cell death while suppressing neuroinflammation with a much higher potency than CQ for both effects./p> 0.05), one-way ANOVA. Data are mean ± s.e.m. n = 8 per group. g, h Immunohistochemical analyses of TH+ neurons by densitometry in the STR. Scale bar, 500 µm. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. i–k Immunohistochemical analyses of TH+ DA neurons (I, j) and NeuN+ neuros (I, k) in the SNpc. Scale bars, 500 µm.One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; j, n = 5 per group; k, n = 4 per group. Data are mean ± s.e.m. l Representative pS129 immunohistochemistry in the SNpc. Scale bars, 250 µm. m, Quantification of pS129 αSyn+ cells by counting. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. n Western blot analyses of human-αSyn in the SNpc of AAV-αSyn-injected mice. Values are expressed as a relative expression compared to contralateral side. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 3 per group. Data are mean ± s.e.m. o–q Immunohistochemical analyses of Iba-1+ microglia by counting in the STR (p) and SNpc (q). One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. Scale bars, 250 µm./p>570 derivatives of CQ and characterized them, resulting in the identification of an optimized agonist, 4A7C-301. Here, we tested 4A7C-301 and CQ for their effects on various in vitro and in vivo models of PD and propose that 4A7C-301 may provide a disease-modifying treatment for PD, as evidenced by the following results./p>20-fold), suggesting a mechanism-based Nurr1 activation. Our data revealed that 4A7C-301 effectively enhances both Nurr1’s transcriptional activator function (e.g., expression of mDAN-specific genes and production of DA in mDANs) and its repressor function (e.g., suppression of pro-inflammatory cytokine genes and microglial activation) with equally greater efficiency than CQ (>20-fold). Second, we observed that treatment with CQ or 4A7C-301 significantly restored Nurr1 protein levels that were reduced by MPP+ treatment and αSyn overexpression without change in their mRNA levels, strongly suggesting that Nurr1 ligands can regulate the levels of Nurr1 protein at the post-transcriptional levels. Thus, we speculate that Nurr1 ligands may regulate Nurr1 protein’s stability, which is vulnerable and down-regulated by environmental (MPP+) and/or genetic (αSyn) toxicity and that 4A7C-301 (and CQ to a lesser degree) exhibits neuroprotective effects by two distinct mechanisms: (1) activating Nurr1’s transcriptional function and (2) stabilizing and restoring Nurr1 protein levels. Third, using diverse cellular models, we found that 4A7C-301 substantially protects mDA cells via multiple downstream pathways such as reduction of oxidative stress and cytotoxicity, protection of mitochondrial function, induction of mDAN-specific gene expression, including GDNF-receptor c-ret, and reduction of neuroinflammation. Furthermore, while CQ inhibits autophagy, 4A7C-301 does not. In fact, 4A7C-301 restores cellular autophagy functions impaired by MPP+ treatment. Since CQ is a prototype autophagy inhibitor and known to accelerate the deposition of αSyn pathology55, CQ’s autophagy inhibition and 4A7C-301’s autophagy protection is an important distinction. We speculate that the same core structure allows CQ and 4A7C-301 to bind Nurr1 (related to the putative SAR) and show similar activities in most assays, while their different side chain structures most likely underlie their distinct effects on autophagy. In support of this, CQ and BafA1, both well-known autophagy inhibitors, significantly increased lysosomal pH, while 4A7C-301 had no effect, suggesting possible mechanisms underlying CQ/4A7C-301’s different effects on autophagy. Fourth, in MPTP- and αSyn-induced mouse models, 4A7C-301 significantly restored motor deficits and non-motor behavior (e.g., olfactory defects) without any dyskinesia-like side effects. A major limitation of current pharmacological treatments of PD is that they eventually induce side effects such as dyskinesia in many patients8,9. As expected, L-DOPA administration induced robust dyskinesia-like behavior in MPTP-induced mice. In sharp contrast, despite comparable improvements in motor tests, treatment with 4A7C-301 or CQ did not induce any detectable dyskinesia-like behavior. A possible action mechanism of 4A7C-301/CQ in the MPTP model is that they may influence metabolism of MPTP to MPP+. However, this explanation is unlikely because 4A7C-301/CQ were administered 6 h post MPTP injection, the time point when MPTP is completely metabolized into MPP+ in both the striatum and SN56./p>50% of the observation time; 3 = display dyskinesia for the entire observation period but ceased upon external stimuli; 4 = display continuous and unceasing dyskinesia). To get a better and more sensitive validation of mice dyskinesia, we included an amplitude AIMs score, which rates the degree of deviation of body part or muscle position from its resting position on a 0-4 scale as previously described8. Finally, global AIMs score was calculated by multiplying basic AIMs and amplitude AIMs scores for each subtype on each session. Data points were plotted as the grand total of individual AIMs score on each testing day./p>
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